非洲豬瘟試劑盒使用說明書

非洲豬瘟試劑盒又稱非洲豬瘟核酸病毒熒光PCR試劑盒，非(fei)洲豬瘟試劑(ji)盒利用實(shi)時熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR原理，可用于檢(jian)測(ce)豬血液、淋巴結、脾臟、扁(bian)桃體等樣本中非(fei)洲豬瘟病(bing)毒的檢(jian)測(ce)。

（快提核酸(suan)擴增試劑盒）

【產品名稱】

通用(yong)名(ming)稱：非洲豬瘟試劑(ji)盒（PCR熒光探(tan)針法） 英文名(ming)稱：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預期用途］

本試劑盒主要用于檢測疑似感染豬(zhu)(zhu)抗凝血及臨床病(bing)(bing)料中的(de)非洲豬(zhu)(zhu)瘟病(bing)(bing)毒（ASFV,African Swine Fever Virus）核酸，適(shi)用于非洲豬(zhu)(zhu)瘟病(bing)(bing)毒的(de)檢測、輔助診(zhen)斷和流(liu)行病(bing)(bing)學調查。

【試劑盒組分】

1、試劑盒組(zu)成及貯藏條件

2、需自備材(cai)料：生理(li)鹽水(shui)、無菌槍頭、熒光PCR專用反應管、記號筆等。

【操作步(bu)驟】一、樣(yang)品制備

1、血(xue)液(ye)樣(yang)品：采集抗凝血(xue)（抗凝劑為(wei)EDTA）或(huo)血(xue)清樣(yang)品，編號備用(yong)。

2、組織(zhi)樣品(pin)：采集(ji)脾(pi)臟、肝臟、淋巴結、扁桃體等(deng)病(bing)變組織(zhi)樣品(pin)或軟蜱0.1g（黃豆(dou)粒大小(xiao)），眼(yan)科剪剪碎于組織(zhi)勻漿器或研缽中(zhong)充分(fen)勻漿或研磨，再加1mL生理鹽(yan)水混勻，4°C條(tiao)件下8000rpm/分(fen)鐘(zhong)離心2分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)液(ye)于滅(mie)菌離心管(guan)中(zhong)，編號備用(yong)。

二、DNA提取

取反應液(ye)(ye)A 20μL分別(bie)加(jia)入到(dao)新的1.5mL離心管(guan)，加(jia)入抗凝(ning)而或血清(qing)或組(zu)織上清(qing)液(ye)(ye)2μL混勻，室溫（20°C左右）靜置3分鐘(zhong)，加(jia)入反應液(ye)(ye)B 20μL,吹打(da)混勻即可，若為抗凝(ning)全血，則(ze)需8000rpm/分鐘(zhong)再(zai)離心2分鐘(zhong)后做為待(dai)檢DNA溶液(ye)(ye)。

二、PCR擴增

1、配液(ye)：取出PCR反(fan)應液(ye)、酶(mei)混合(he)(he)液(ye)，在室(shi)溫完(wan)全融(rong)化后，充(chong)(chong)分(fen)(fen)混勻，瞬離，可(ke)將酶(mei)混合(he)(he)液(ye)全部取岀直接加入到PCR反(fan)應液(ye)中(zhong)，充(chong)(chong)分(fen)(fen)混勻，瞬離后按每份(fen)(fen)20μL分(fen)(fen)裝(zhuang)(zhuang)使用；或按照每份(fen)(fen)PCR反(fan)應液(ye)17μL,酶(mei)混合(he)(he)液(ye)3μL的(de)比例取一定的(de)試驗用量，混合(he)(he)兩種反(fan)應液(ye),瞬離后按照每份(fen)(fen)20μL分(fen)(fen)裝(zhuang)(zhuang)到專用熒光(guang)(guang)PCR 反(fan)應管中(zhong)，剩余試劑立(li)即凍(dong)存；（操作(zuo)過程要注意避光(guang)(guang)）

2、加樣擴增：分別向上(shang)述PCR反應(ying)管(guan)中加入(ru)5μL樣本 DNA或(huo)陰性(xing)對(dui)照或(huo)陽性(xing)對(dui)照，混勻并瞬離(li),放入(ru)熒光(guang)PCR儀上(shang)運行以下程序(xu)：

步驟 條件 循(xun)環數 UNG處理 50°C：2分鐘(zhong)1 預變性(xing) 95°C：3分鐘(zhong)1 預擴(kuo)増 95°C：8秒(miao)55C：8秒(miao)5 PCR擴(kuo)增 95°C：8秒(miao)55°C：8秒(miao)40

熒光通道選擇FAM,在40循(xun)(xun)環階段每個循(xun)(xun)壞(huai)的55°C時收集熒光信(xin)號。設置(zhi)擴增體系為(wei)25μL,同時要選擇 passive reference 和 quencher 為(wei) none 的模(mo)式。

(注:若熒光PCR儀(yi)(如ABI7500)按說明書中的反應程序設(she)置后因持溫時(shi)間短無(wu)法運行,可將預擴(kuo)增(zeng)和PCR擴(kuo)增(zeng)條(tiao)件變更為(wei)95°C：5秒55°C：30秒。)

【結(jie)果(guo)判定(ding)】1、基線和閾(yu)值(zhi)設(she)定(ding)；基線調整(zheng)取(qu)6-15個(ge)循環的(de)(de)熒(ying)光(guang)信號，閾(yu)值(zhi)設(she)定(ding)以閾(yu)值(zhi)線剛好超過陰性(xing)對(dui)照檢(jian)測熒(ying)光(guang)曲線的(de)(de)最(zui)高(gao)點為原則。

2、質量控制：反應結束(shu)后，陰性(xing)對照(zhao)(zhao)的檢測(ce)結果應無特定的擴增(zeng)曲線，Ct值(zhi)為＞38或無；陽性(xing)對照(zhao)(zhao) 的Ct值(zhi)應≤30.0,且明顯的擴增(zeng)曲線；否則實驗(yan)視為無效。

3、樣品(pin)判(pan)定(ding)(ding)：待(dai)檢樣品(pin)熒光信(xin)號有指(zhi)數型(xing)增加，且(qie)結(jie)果(guo)顯示(shi)Ct值(zhi)<35.0,報告(gao)為陽性(xing)；未檢測到Ct 值(zhi)或Ct值(zhi)＞38或無明顯擴(kuo)增曲線，則(ze)(ze)樣品(pin)判(pan)定(ding)(ding)為陰(yin)(yin)性(xing)。35≤Ct值(zhi)≤8時(shi)，復檢一次，重復結(jie)果(guo)為陽性(xing)者判(pan)定(ding)(ding)為陽性(xing)，否則(ze)(ze)判(pan)定(ding)(ding)為陰(yin)(yin)性(xing)。

【注意事項】1、實驗前(qian)請仔細閱讀本試(shi)劑(ji)盒說明書，嚴格按照操(cao)作(zuo)步驟執(zhi)行，在操(cao)作(zuo)過(guo)程中對時(shi)間(jian)、試(shi)劑(ji)體積等精確控制可(ke)以獲得最好的結果。

2、實驗室應嚴(yan)格按照有關規(gui)定分區(qu)(qu)管理(li)。各區(qu)(qu)間(jian)人員(yuan)、器材、試(shi)劑及空氣流向應有產格要求(qiu)。

3、有關(guan)耗材確保潔(jie)凈、無菌，核酸提取完成后盡(jin)快進入(ru)下一步試驗(yan)或冷(leng)凍保存。

4、預(yu)混后的試劑應盡量在短(duan)期內(nei)使(shi)用完畢(bi)，戶外使(shi)用應在加(jia)冰袋(dai)的泡(pao)沫盒(he)保(bao)存，每日試驗完畢(bi)應及(ji)時冷(leng)凍保(bao)存。

5、對于熒光(guang)PCR管要避免徒(tu)手(shou)或使用過的(de)手(shou)套(tao)接觸，檢測過程中使用不帶熒光(guang)物質(zhi)一次(ci)性(xing)乳膠手(shou)套(tao)。

6、凍存試劑使用前應于(yu)室溫下完全融化(hua)，充分混勻，瞬時離心使液體完全沉于(yu)管底。

7、樣品、陰(yin)性對(dui)(dui)照封蓋后，在通風(feng)環境(jing)添加陽(yang)性對(dui)(dui)照并及時封蓋，避免組分間及氣溶(rong)膠等假陽(yang)性污染。

8、擴增反(fan)應完畢后(hou)的PCR管嚴(yan)禁開蓋,應和(he)試驗產生(sheng)的其它廢棄(qi)物一起及時(shi)收集,遠離PCR實(shi)驗室進行(xing)無害化處理。

【規格】50頭份/盒。

【貯藏(zang)與有效期】-20°C以下避光(guang)保存，有效期12個(ge)月。

僅供獸醫診斷使用