養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒（柱膜法）使用說明書

養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒又稱環境檢測非洲豬瘟試劑盒，養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測非洲豬瘟(wen)病毒的試劑盒。

【產品名(ming)(ming)稱】通(tong)用名(ming)(ming)稱：病(bing)毒DNA提取試劑盒

英(ying)文名稱：Extraction Kit for Virus DNA

【預期用(yong)途】本(ben)試劑盒主要用(yong)于(yu)疑似病(bing)毒等(deng)病(bing)原感染(ran)抗凝(ning)血、血淸、拭子、組織、飼料(liao)及環境(jing)中的(de)病(bing)毒DNA的(de)提(ti)取，純化的(de)核酸可適用(yong)于(yu)各種(zhong)常規操作及PCR試驗。

【試劑盒組分】

I、試劑盒組成及貯藏條件 名稱(cheng) 20T 50T

1、吸附柱 20個 50個 2、收(shou)集(ji)管 20個 50個 3、裂解液(ye) 5mL11mL4、洗液(ye)I13mL32mL5,洗液(ye)II13mL32mL6.洗脫液(ye)1.2mL3mL

2、保存條件及有(you)(you)效(xiao)期：室溫(wen)下保存，有(you)(you)效(xiao)期12個月.

3、需自備材料：無(wu)(wu)水乙醇、1.5mL無(wu)(wu)菌離心管、1.5mL無(wu)(wu)菌離心管（長臂(bei)型）、生(sheng)理鹽(yan)水、研(yan)缽、無(wu)(wu)菌1mL,2OOuL、10uL槍(qiang)頭、記號筆(bi)等(deng)。

【操作步驟】

一、樣品制備

1、血(xue)(xue)液樣品(pin)(pin)：抗凝(ning)血(xue)(xue)樣品(pin)(pin)置(zhi)離(li)(li)心(xin)管(guan)中，8000轉/分(fen)鐘(zhong)離(li)(li)心(xin)2分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)層(ceng)血(xue)(xue)漿；非抗凝(ning)血(xue)(xue)樣品(pin)(pin)置(zhi)離(li)(li)心(xin)管(guan)中，待(dai)凝(ning)固后，8000轉/分(fen)鐘(zhong)離(li)(li)心(xin)2分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)層(ceng)血(xue)(xue)清(qing)，置(zhi)于滅菌(jun)離(li)(li)心(xin)管(guan)中，編(bian)號待(dai)檢。

2、組(zu)織(zhi)樣(yang)品：采集脾(pi)臟(zang)、肝臟(zang)、淋巴結、扁桃體等病(bing)變(bian)組(zu)織(zhi)樣(yang)品0.1g.組(zu)織(zhi)勻(yun)漿(jiang)器(qi)或(huo)研缽(bo)中充分勻(yun)漿(jiang)或(huo)研磨，加入1mL生理鹽水(shui)混勻(yun)，8000轉(zhuan)/分鐘離心(xin)(xin)2分鐘，取(qu)上(shang)清于(yu)滅菌離心(xin)(xin)骨(gu)中，編號待檢。

3、口腔液(ye)：進(jin)食(shi)前用拭子/口腔液(ye)采集袋或自制(zhi)棉線(xian)綁紗布團吸引動(dong)物咀嚼，收集口腔液(ye)大(da)于500uL，8000轉/分(fen)(fen)鐘離心2分(fen)(fen)鐘，取上清(qing)于滅菌離心管中，編號(hao)待檢。

4、飼料(liao)：取(qu)適(shi)量研磨后(hou)的(de)飼料(liao)（約0.2g），放(fang)入含1mL生理鹽(yan)水(shui)或PBS（PH為7.4）緩沖液的(de)2mLEP管屮，振蕩(dang)混勻，8000轉/分鐘(zhong)(zhong)離心2分鐘(zhong)(zhong)，取(qu)上清于滅菌離心管中(zhong),編號待檢.

5、灰(hui)(hui)塵：用無菌棉簽蘸(zhan)取適量(liang)環境表面上的灰(hui)(hui)塵，放入含(han)1mL生理鹽水或PBS（PH為7.4）緩(huan)沖液的2mLEP管中，振蕩混勻，8000轉/分(fen)鐘離(li)心(xin)2分(fen)鐘，取上清于(yu)滅菌離(li)心(xin)管中，編號待(dai)檢。

二、DNA的提取

1、取(qu)裂解液200uL加入(ru)(ru)無(wu)核(he)酸酶1.5mL離心曾屮，分(fen)別加入(ru)(ru)血漿(jiang)/血清(qing)/組織(zhi)液等樣(yang)品(pin)(pin)液200uL.震蕩混(hun)勻(yun)10秒(miao)或(huo)顛倒混(hun)勻(yun)10次，室溫放置5分(fen)鐘（如果室內溫度較低(di)時(shi).需(xu)放置25C水浴溫育），再加入(ru)(ru)200uL無(wu)水乙醇，顛倒混(hun)勻(yun)10秒(miao)；若(ruo)樣(yang)品(pin)(pin)渾濁則先12000轉/分(fen)鐘離心1分(fen)鐘處理，取(qu)上(shang)清(qing)液，以避免堵(du)塞柱(zhu)子；

2、將液體轉入(ru)套有收(shou)集管的吸附柱中，12000rpm離(li)心1分鐘(zhong)：

3、棄(qi)收集管液體，向吸附柱中加(jia)600uL洗液I,12000rpm離心(xin)1分鐘;

4、棄收集管液體，向吸附柱中加(jia)600uL洗液II，12000rpm離(li)心I分(fen)鐘；

5、棄收集管液(ye)體，12000rpm離心2分(fen)鐘，以徹底(di)去(qu)除殘留洗(xi)液(ye)；

6、將吸附柱轉入新的(de)無核酸酸1.5mLEP管（長臂型）中，向柱中央滴加50uL洗脫(tuo)液，靜置1分(fen)鐘,12000rpm離心(xin)1分(fen)鐘，EP管中液體即為病毒DNA。

【注意事項】1、實驗前諾仔細閱讀本試劑(ji)(ji)盒(he)說明(ming)書，嚴格按照操作步(bu)驟(zou)執(zhi)行.在操作過程中對時間(jian)、試劑(ji)(ji)體積等粘(zhan)確控制(zhi)可以獲得最(zui)好的(de)結果

2,樣(yang)本應(ying)新鮮采集使用(yong)，或低溫(wen)運輸儲存；

3,樣本具有潛在感染(ran)風(feng)險，核酸的(de)提取(qu)應(ying)在核酸提取(qu)實驗室的(de)生物(wu)安(an)全柜中進行(xing)。

4、核酸提取冇(mao)關耗材確保高溫滅菌，提取后核酸盡快進入下(xia)一步試驗或冷(leng)凍(dong)保存待用(yong)。

5,試劑(ji)使(shi)用(yong)前應(ying)混合(he)均勻(yun)，試劑(ji)具有一定腐蝕性，使(shi)用(yong)時(shi)請戴手套、口(kou)罩做好防護(hu)。

6.低溫(wen)下(xia)裂解液出現結晶數屬正常現象(xiang)，可在60°C水浴加熱(re)助(zhu)溶后使(shi)用(yong)。

7、實驗產生的廢棄物(wu)應及(ji)時(shi)收集(ji)，遠離PCR實驗室進行無害化處理。

僅供獸醫診斷使用

非洲(zhou)豬瘟病(bing)毒熒光PCR核(he)酸檢測試劑盒說明書【獸(shou)藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟(wen)病毒熒(ying)光PCR核酸檢測試劑盒

漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名(ming)稱(cheng)：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名稱：無

【主要成分與含(han)(han)量(liang)】試劑盒(he)中含(han)(han)有如下(xia)組分:試劑盒(he)組分含(han)(han)量(liang)，陽性(xing)對(dui)照250μL/管(guan)×1管(guan)，陰性(xing)對(dui)照250μL/管(guan)×1管(guan)，PCR反應(ying)液850μL/管(guan)×1管(guan)，萌混合液150μL/管(guan)×1管(guan)，說明書1份(fen)/盒(he)

【作用與用途】本試(shi)劑(ji)盒(he)可用于血液、脾臟(zang)、肝(gan)臟(zang)、淋巴結、樣品(pin)中非洲(zhou)豬瘟病毒(du)核(he)酸的檢測。扁(bian)桃體(ti)、腎臟(zang)、肌肉、環境樣品(pin)等(deng)

【用法與判定】

1用法

1.1待(dai)檢樣(yang)品釆(bian)集(ji)、保存(cun)及運(yun)輸(shu)

1.1.1樣品釆集

（1）活豬樣品 無菌采集(ji)抗凝血(xue)或血(xue)清(qing)5mL

（2）病死豬(zhu)剖檢(jian)樣品或(huo)屠(tu)宰場(chang)剖檢(jian)樣品，無菌采(cai)集死豬(zhu)的牌、肺、腎(shen)、扁桃(tao)體、淋(lin)巴(ba)結(jie)、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運(yun)至實驗室用于檢(jian)測。

（3）病豬污染的周邊環境 采集與病豬相關場(chang)所的糞便、飼料(liao)、污水樣(yang)品(pin)。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

1.1.2樣品保存

采集的樣品在(zai)2?8°C保(bao)存應不超過24小時，-70°C條件下(xia)保(bao)存，避(bi)免(mian)反復凍融。

1.1.3樣品運輸

泡沫箱加冰袋后(hou)密(mi)封進(jin)行運(yun)(yun)輸。包裝和運(yun)(yun)輸應符合農(nong)業(ye)農(nong)村(cun)部《高(gao)致病性動(dong)物病原(yuan)微生物菌(jun)（毒）種或者樣品運(yun)(yun)輸包裝規范》和交通運(yun)(yun)輸部門關(guan)于危險品運(yun)(yun)輸管理(li)的(de)有關(guan)規定(ding)。

1.2樣品處理

1.2.1血液樣品處(chu)理

抗凝血(xue)樣(yang)品置于離(li)(li)心管中(zhong)，8000r/min離(li)(li)心2分鐘(zhong)取上層(ceng)血(xue)漿(jiang)，編號(hao)待(dai)(dai)(dai)檢。非抗凝血(xue)樣(yang)品置于離(li)(li)心管中(zhong)，待(dai)(dai)(dai)凝固(gu)后(hou)，8000r/min離(li)(li)心2分鐘(zhong)取200μL上層(ceng)血(xue)清(qing)，編號(hao)待(dai)(dai)(dai)檢。

1.2.2組織樣(yang)品處理

取適(shi)量脾臟、肝(gan)臟、淋巴結、扁(bian)桃體、肌肉等組織(zhi)，置于(yu)研磨器或研磨管中研磨，再加適(shi)量生(sheng)理鹽水混勻，制(zhi)成(cheng)約10%的組織(zhi)勻漿，8000r/min離(li)心(xin)2分鐘(zhong)，取200μL上 清于(yu)RNase/DNase-free無菌離(li)心(xin)管中，編號(hao)備用(yong)。

1.2.3環境樣品(pin)處(chu)理

1.2.3.1糞(fen)便、飼料(liao)樣品處理方(fang)法

取適量的糞便(bian)、飼(si)料放入(ru)盛有(you)PBS緩沖(chong)液的研(yan)磨管中(zhong)研(yan)磨混勻，制(zhi)成(cheng)約(yue)10%的勻漿液.8000r/min離(li)心2分鐘，取200μL上(shang)清于RNase/DNase-free無菌離(li)心管中(zhong)，編(bian)號備用。

1.2.3.2污(wu)水樣品處理方法

直接取200μL污(wu)水進行核酸提取。

1.3病毒核酸的(de)提取用(yong)磁珠(zhu)法(fa)或(huo)柱(zhu)式法(fa)進行DNA核酸提取。

1.4熒(ying)光(guang)PCR反應：

1.4.1從試(shi)劑盒(he)中取(qu)出熒光PCR反(fan)應(ying)(ying)液、酶(mei)混合液，室溫融化后，2000r/min離(li)心5秒。設(she)被檢(jian)樣品、陽性對(dui)照(zhao)和(he)陰性對(dui)照(zhao)總和(he)為n,則反(fan)應(ying)(ying)體系(xi)配制如下：

試劑體系

PCR 反應(ying)液17× (n+1) μL

酶混(hun)合液3× (n+1) μL

1.4.2在新(xin)的(de)RNase/DNase-fire1.5mL離(li)心(xin)管中加入上述試(shi)劑，充分混勻后瞬(shun)時離(li)心(xin)。按(an)照20μL/管分裝(zhuang)量將試(shi)劑分裝(zhuang)至(zhi)熒光PCR反應管。

1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應管蓋，混勻后瞬時離心，轉移到熒光PCR儀器 上。

144將PCR反應管放置在(zai)(zai)熒光(guang)(guang)PCR儀(yi)樣品(pin)槽中(zhong)，在(zai)(zai)熒光(guang)(guang)PCR儀(yi)上(shang)運(yun)行以下程序：

步(bu)驟(zou) 條(tiao)件(jian) 循環數 UNG處理 50℃,2分鐘1 預(yu)變性 95℃,3分鐘1 預(yu)擴增 95℃：8秒55℃：8秒5 PCR擴増 95℃：8秒55℃：8秒40

熒光通道選擇FAM,在PCR擴(kuo)(kuo)增階段每(mei)個循環的(de)(de)55℃時(shi)(shi)采集熒光信號。設置擴(kuo)(kuo)增體系為25μL,同時(shi)(shi)要(yao)選擇passive reference和quencher為none的(de)(de)模(mo)式(shi)。（注：若(ruo)熒光PCR儀（如AB17500）按說明(ming) 書中的(de)(de)反(fan)應程(cheng)序設置后因持溫時(shi)(shi)間短無法(fa)運行，可將預擴(kuo)(kuo)增和PCR擴(kuo)(kuo)增條件變更為95C：5秒55°C：30秒）

2結果判定

2.1試驗有效性判(pan)定

陽性對照有(you)典型擴增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴增曲線，線形為(wei)直線或輕微斜線，無指(zhi)數增長期(qi)。則判(pan)試(shi)驗結(jie)果有(you)效。否則，此次試(shi)驗視為(wei)無效。

2.2樣品判定

2.2.1陽性：樣本檢(jian)測結果Ct值≤35且有明顯指數增長期，判定檢(jian)出非(fei)洲豬(zhu)瘟病毒核(he)酸(suan)。

2.2.2可疑：樣本(ben)檢測結果(guo)Ct值在(zai)35?38范(fan)圍(wei)內。此時應對樣本(ben)進行重復(fu)檢測，如果(guo)重復(fu)實驗結果(guo)Ct值仍在(zai)35?38范(fan)圍(wei)內，有明顯指數增長期.則判定為(wei)陽性，否則為(wei)陰性。

2.2.3陰(yin)性：樣本檢(jian)(jian)測結果(guo)Ct值(zhi)＞38或無Ct值(zhi)，判定未檢(jian)(jian)出非洲豬瘟(wen)病毒核酸。

【注意(yi)事(shi)項(xiang)】（1）實驗(yan)前(qian)請仔細(xi)閱讀(du)本試劑盒(he)說明書，嚴格按照操作步驟(zou)執行，在操作過程(cheng)中對時(shi)間(jian)、試劑體積等精確控制可(ke)以(yi)獲得最(zui)好的結果。

（2）實驗室應嚴(yan)(yan)格按照有關規定(ding)分區(qu)管理，依照配液區(qu)-模板提取區(qu)-擴(kuo)增(zeng)區(qu)-分析區(qu)順序(xu)進(jin)行基因檢測。各區(qu)間人(ren)員、器材(cai)、試劑(ji)及空氣流向應有嚴(yan)(yan)格要求(qiu)。

（3）核酸提(ti)取有關耗村確保潔凈、無(wu)DNase/RNase,提(ti)取過程盡量低溫、快速，完成后進入(ru)下一步實驗或(huo)凍保。

（4）對于頂部采(cai)光儀器要帶(dai)新的一次性PE手套(tao)對熒光PCR管封(feng)蓋，對于底(di)部采(cai)光儀

器(qi)要(yao)避免徒手或(huo)使用過的手套接觸熒光(guang)PCR管底，檢測過程中(zhong)使用不帶熒光(guang)物(wu)質一次性(xing)乳膠(jiao)手套。

（5）凍(dong)存試(shi)劑(ji)使用前應于室溫下完全融化，瞬時離心(xin)使液體完全沉于管底。避免反復凍(dong)融，以(yi)免影響試(shi)劑(ji)性能。

（6）樣品、陽性(xing)對照等(deng)在使用后及時(shi)封蓋，.避免組分間及氣溶(rong)膠等(deng)的污染(ran)造成假陽性(xing)。

（7）擴增產(chan)(chan)物禁止開蓋，實驗(yan)產(chan)(chan)生的廢棄(qi)物應及(ji)時收(shou)集，遠離PCR實驗(yan)室進(jin)行無害化(hua)處理。

【規(gui)格】50頭份/盒(he)

【貯藏與有效期】試(shi)劑(ji)盒(he)置(zhi)-20°C以下避光保存，有效期12個月(yue)。

【批(pi)準文號】獸(shou)藥(yao)生(sheng)字163668871

僅供獸醫診斷使用